Princípios Clonagem Molecular

Hoje vamos discutir sobre a Clonagem Molecular, que seria o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e de sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante.

A clonagem molecular permite que os estudos dos genes e seus produtos sejam mais específicos, que os organismos transgênicos existam e também que seja possível realizar a Terapia Gênica (em breve, prometo!!!)

Para se obter um DNA recombinante, é necessário que se tenha um plasmídeo. O que seria plasmídeo?

Plasmídeos são vetores pequeno de DNA, são moléculas circulares e naturais em bactérias e que são transmitidas a partir do pilo sexual para que se obtenha genes que ainda não possuem, podem ser moléculas extracromossômicas, porém também podem se integrar ao genoma bacteriano.

O plasmídeo é DNA e com isso realiza os mesmos processos, ou seja, é replicado, é transcrito e traduzido. Por causa disso é um alvo importante de estudos, pois essas moléculas podem ser construídos e inseridos no organismo de interesse.

Na imagem é possível ver o plasmídeo pXG1, utilizado no meu projeto de iniciação científica. para que todo plasmídeo seja útil é necessário que tenha Origem de replicação, indicada pela seta cinza, MSC (múltiplos sítios de clonagem) local que é inserido o gene de interesse, no caso é onde vemos a seta vermelha com "LmjEXO1", e ao menos um gene de resistência a antibióticos, no plasmídeo indicado tem dois genes Neo-R (resistência a neomicina) e Amp-R (resistência a ampicilina).

Pronto, o plasmídeo está construído. E agora? Faço uma prece para que ele entre no organismo que eu quero estudar? Não!! Vamos agora aos métodos de inserção de plasmídeos dentro da célula.

A transformação bacteriana é a principal forma de inserção do plasmídeo na célula, para realizar esse processo, e as duas formas mais utilizadas para realizar esse passo, são a Eletroporação e por Cloreto de Cálcio.

A Eletroporação envolve colocar as bactérias em solução, esta é exposta a pulsos elétricos de alta voltagem que irão provocar a abertura de poros na membrana celular e com isso permite a entrada do plasmídeo. Enquanto por Cloreto de Cálcio provoca um choque térmico, que neutraliza as cargas negativas do DNA e da membrana celular, facilitando a entrada do vetor (exatamente no momento do choque).

Depois de realizarmos uma dessas técnicas, precisamos saber se o plasmídeo entrou mesmo nas células, como fazemos isso, essa seleção?

Agora aparecem os genes de resistência.

É feito o cultivo das bactérias em meio com o antibiótico que o plasmídeo tem o gene de resistência. As bactérias que crescerem no meio, são as bactérias que tem o plasmídeo. Porém, isso não impede que o plasmídeo tenha incorporado o gene de interesse de forma incorreta, então é necessária fazer nova seleção. Sempre é colocado marcadores no gene de interesse para que esse quando for expresso possa ser selecionado.

Normalmente esse processo tem pouquíssima efetividade, poucas bactérias irão possuir o plasmídeo corretamente.

Para resumir tudo que eu disse.