Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Muitos sabem o que é a PCR, afinal é (quase) um pré requisito para ser um Biomédico, hoje vou falar um pouquinho sobre a reação, como ela acontece e algumas de suas variações.
A PCR é a reação de amplificação de DNA in vitro, a técnica representa o processo de replicação de DNA em um tubo Eppendorf. A reação precisa de variações de temperatura para poder acontecer, e antes de se descobrir a Taq DNA Polimerase a reação era manual, o que devia tornar a técnica extremante exaustiva, pois a cada ciclo devia adicionar mais Polimerase para realizar a amplificação.
O ciclo de temperaturas é repetido por cerca de 30 vezes, para se garantir que a reação gere uma quantidade boa de amostra. O processo inicia-se em 96°C (desnaturação da molécula de DNA molde), depois 60°C (anelamento, ou seja, ligação do primer com a molécula de DNA molde) e por fim 72°C (extensão do DNA).
Lembrando que para que a reação aconteça é extremamente necessário que se tenha 7 "ingredientes", que seriam: 2 primers de RNA específicos para a região de interesse (que seriam os iniciadores), dNTPS (que dão origem aos nucleotídeos), Mg+ (Cofator para a Taq DNA Polimerase), agente tamponante e água. Além, claro, da Taq DNA Polimerase e o DNA amostral.
Existem diversos tipos de PCR e acredito que se eu ficar falando aqui, essa postagem vai longe, porém vou falar de algumas, que foram as que mais foram utilizadas e apresentadas no curso (para mim) até agora.
PCR-Multiplex – Utilização de vários primers de RNA e com isso consegue amplificar vários alvos simultaneamente.
PCR-RFLP – amplificação do fragmento de restrição (após utilização de enzimas de restrição)
PCR-RT (Transcriptase reversa) – Utilizada para adquirir cDNA a partir do mRNA e assim poder obter informações sobre a proteína formada, normalmente realiza a PCR convencional, para se amplificar a quantidade de cDNA obtida.
qPCR ou PCR Real Time – utilizada para QUANTIFICAÇÃO de DNA na amostra, essa quantificação acontece durante toda a reação. E para que isso aconteça é necessário que utilize-se marcadores de DNA, seja corante como o SYBR green (cora todas as moléculas de DNA em dupla fita), como por sondas sequência-específica como o TaqMan (pode utilizar mais de uma cor, com isso pode ser utilizada em Multiplex e é mais ESPECÍFICA), ambas tem a mesma função, que seria marcar o DNA.
Para garantir que os resultados sejam confiáveis, realiza-se a curva de dissociação.
E o que seria? A curva de dissociação é construída a partir da TM (time-melting ou seja tempo de desnaturação) das moléculas de DNA, se todas tiverem o mesmo pico, significa que não houve contaminação da reação e com isso que a sua reação foi efetiva e confiável.
Importante ressaltar que a qPCR pode ser uma PCR Multiplex, porém o inverso não é verdadeiro.
A utilização da técnica é infinita, uma vez que pode ser utilizada para encontrar agente patogênicos, identificar indivíduos, utilizar em pesquisa. Use a sua criatividade que você com certeza encontrará uma utilidade para a PCR.
Saudações Biomédicas
